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吡格列酮对游离脂肪酸作用下βTC细胞GPR表达的干预作用::作者:张贝蕾杨立勇编辑:studa【摘要】目的探讨游离脂肪酸(FFA)作用下胰岛βTC细胞G蛋白受体(GPR)mRNA表达的改变以及吡格列酮(Piog)对此改变的干预作用。 方法以βTC细胞为研究对象分为对照组及FFA组(及mmolL)。

半定量RTPCR方法检测GPR的表达。 用不同浓度的Piog(μmolL)预孵育βTC细胞h加入mmolLFFA继续孵育h半定量RTPCR方法检测GPR的表达。 结果()FFA孵育h后各组间GPR的表达差别无统计学意义。 ()FFA孵育h后与对照组比较mmolLFFA组GPR的表达无差异但mmolL和mmolLFFA组GPR表达下调(P)mmolL与mmolLFFA组比较GPR表达差别无统计学意义。 ()与mmolLFFA组比较μmolLPiogmmolLFFA组GPRmRNA表达无差异而μmolLPiogmmolLFFA组和μmolLmmolLFFA组GPR表达升高(P)。

结论长期高浓度FFA作用能够下调βTC细胞GPR的表达而Piog有助于保护或减轻FFA水平异常导致的βTC细胞GPR表达的损害。

【关键词】噻唑烷二酮类PPARγ脂肪酸类糖尿病型受体G蛋白偶联ofGPRinβTCcellsinducedbyfreefattyacids(FFA)andtheinterventioneffectofpioglitazone(Piog)onthoseexpressionsMethodsβTCcellsstudiedintheexperimentweresubjecttodifferenttreatmentswithablankandthreeconcentrationsofFFA(,andmmolL)SemiquantitativeRTPCRanalysiswasusedtodeterminetheRNAexpressionlevelofGPRinβTCcellsafterhoursandhoursrespectivelyAfterwards,βTCcellswerepreincubatedwithdifferentconcentrationsofPiog(,,,μmolL)forhours,andmmolLFFAwasthenaddedandthecellswereincubatedforanotherhoursTheRNAexpressionlevelofGPRwasdeterminedbysemiquantitativeRTPCRatlastResults()AfterthecellswereincubatedwithFFAofdifferentconcentrationsforhours,therewasnostatisticallysignificantdifferenceamongallthegroups()Afterthehourincubation,nodifferencewasshownbetweenthegroupwithmmolLFFAandthecontrolgroupButcomparedtothecontrolgroupandthegroupwithmmolLFFA,theexpressionofGPRinβTCcellsinbothgroupswithmmolLFFAandthatwithmmolLFFAdecreasedafterthehourincubation(P)Therewas,however,nostatisticaldifferencebetweenthegroupwithmmolLFFAandthatwithmmolLFFA()ThoughnostatisticallysignificantdifferencewasfoundbetweenthegroupwithμmolLPiogmmolLFFAandthatwithmmolLFFA,theRNAexpressionlevelofGPRinboththegroupwithμmolLPiogmmolLFFAandthatwithμmolLPiogmmolLFFAincreasedcomparedtothegroupwithmmolLFFA(P)ConclusionTheexpressionofGPRinβTCcellsmaybeinhibitedbylongtermadministrationofFFAofhighconcentration,whilePiogcanhelptoprotecttheexpressionofGPRagainstFFAinducedimpairmentinβTCcellKEYWORDS:thiazolidinedionesfattyacidsPPARgammadiabetesmellitus,typereceptors,Gproteincoupled游离脂肪酸(FFA)对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响具有双向性短期作用刺激其分泌而长期作用则损害胰岛素分泌功能但其机制尚不清楚。 近年来的研究表明孤儿型G蛋白偶联受体(GPR)是中、长链FFA的特异性受体并在胰岛β细胞膜上大量表达。 中、长链FFA能够通过活化GPR从而促使胰腺分泌胰岛素(GSIS)。 过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是一类由配体激活的核转录因子近年来已经发现其在胰岛β细胞上高度表达,可保护β细胞免于FFA介导的损害,。

本研究观察FFA与过氧化物酶体增殖物激活受体γ激活剂吡格列酮(Piog)对体外培养的胰岛βTC细胞GPR表达影响以期为拮抗FFA的脂毒性作用以保护胰岛β细胞以及进一步评估PPARγ受体对糖、脂代谢的调控作用提供参考。

材料与方法细胞和试剂小鼠胰岛β细胞瘤细胞系的βTC细胞(福建医科大学分子医学中心馈赠)。 DMEM培养基(美国GIBCO公司)油酸和棕榈酸均(美国Sigma公司)Piog(恒瑞集团江苏德源药业有限公司)。

方法FFA溶液的制备FFA贮备液中油酸与棕榈酸的比例为∶。 溶解所需剂量的油酸和棕榈酸于mL酒精中振摇h。 每mmolLFFA加入μL的NaOH(molL)混匀置于通风橱中过夜干燥。 加入mL蒸馏水加热溶液至呈透明皂液样时加入mL冰冷的小牛血清白蛋白混匀。 经μmCA过滤器过滤消毒后将FFA贮备液存于℃。

Piog溶液的制备量取Piogmg用DMSO溶液溶解稀释配制成mmolL的母液过滤除菌℃保存使用前用DMEM培养液稀释成所需浓度并使培养液中DMSO的终浓度不高于%。

细胞培养与分组βTC细胞以×mL的浓度接种于孔培养板中培养进入对数生长期后进行干预实验。

FFA干预试验将细胞分成组:空白对照组(只加含胎牛血清的DMEM培养液)mmolLFFA组mmolLFFA组mmolLFFA组。 分别加入含不同浓度的FFA或不含FFA(对照组)的DMEM培养液培养h或h。

Piog与FFA共同干预试验将细胞分成组:mmolLFFA组(不加Piog)μmolLPiogmmolLFFA组μmolLPiogmmolLFFA组μmolLPiogmmolLFFA组。 各组先加入不同浓度的Piog培养h再加入FFA并使其终浓度为mmolL继续培养h。 细胞总RNA的制备细胞用PBS冲洗两遍后采用Trizol一步法提取细胞总RNA并取少量样品作紫外扫描分析和琼脂糖电泳分析其余℃保存。 RTPCR试验RTPCR引物引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。 GPR(bp):F:’AACTTGTTAGCCATCCGAGGC’R:’TTCCGTTTGTGGCTCAGGC’F:’TTGCCTTGGCCCACTTTG’R:’GAGCCATTCACGGGTATGTTG’内对照小鼠β肌动蛋白(βactinbp):F:’GCTACAGCTTCACCACCACAG’R:’GGTCTTTACGGATGTCAACGTC’cDNA第一链的合成取总RNAμg以Oligo(dT)Primer为引物组成总体积为μL的逆转录反应体系℃孵育min℃min终止反应将cDNA产物于℃保存。 PCR反应PCR反应扩增目标cDNA:参照×TaqPCRMasterMix(北京天为时代科技有限公司)试剂盒说明加入μLPCR反应体系(cDNA模板μLmmolLPrimerⅠ上游引物μLmmolLPrimerⅡ下游引物μL×MasterMixμLddHOμL)。

βactin的反应参数:℃min→℃s→℃s→℃s个循环最终延伸℃minGPR反应参数:℃min→℃s→℃s→℃s个循环最终延伸℃minGPR反应参数℃min→℃s→℃s→℃s个循环最终延伸℃min产物在琼脂糖凝胶上进行电泳用凝胶成像系统对DNA条带进行光密度扫描以目的基因βactin的比值表示相对表达水平。

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